我们常用的湿热灭菌，其效果验证主要由物理确认和生物学确认两部分构成。

生物学确认则主要是微生物挑战试验，该实验是将一定量、已知特性值的耐热芽孢（即生物指示剂）在设定的湿热灭菌条件下进行灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能使产品达到预定的无菌保证水平。

最终生物指示剂被杀灭的程度，是评价一个灭菌程序有效性的直观指标。

今天我们就给大家简单介绍一下生物指示剂。

  生物指示剂一种对特定灭菌程序有确定及稳定耐受性的特殊活微生物制成品，可用于灭菌设备的性能确认，特定物品的灭菌工艺研发、建立、验证，生产过程灭菌效果的监控 ，也可用于隔离系统和无菌洁净室除菌效果的验证评估等。（——源自《中华人民共和国药典2020年版 四部》中的1421 灭菌法、9207灭菌用生物指示剂指导原则）

生物指示剂主要分为三大类：

芽孢悬液生物指示剂，例如安瓿式生物指示剂，主要用于湿热灭菌的液体灭菌验证，置于液体中进行使用。

自含式生物指示剂主要用于湿热灭菌中饱和蒸汽灭菌的验证，需与被灭菌物品—起置于灭菌舱内进行使用。例如，检测实验室常用手提式或立式的蒸汽高压灭菌锅对培养基、试剂及实验用具进行灭菌，其灭菌效果需定期使用自含式生物指示剂进行验证。

使用方法

将生物指示剂垂直放入56℃—60℃ 培养箱内培养，同时取一支未经灭菌的指示剂，同上处理，同步放入培养箱培养作为阳性对照管，同时培养24-48h，观察结果。

A. 培养后当生物指示剂管内培养液由紫色变为黄色，即表示有菌生长，判定灭菌不合格；

B. 培养后当生物指示剂管内仍为紫色表示无菌生长，阳性对照培养液由紫色变为黄色，判定为灭菌合格。

生物指示剂主要性能指标为：菌种及其纯度、总孢子数、D值、存活时间、杀灭时间。 

● 总孢子数：生物指示剂芽孢含量应在90%以上，湿热灭菌生物指示剂的芽孢数范围一般在1.0×105〜5.0×106CFU。（依据中国药典2020版四部9208进行检测） 

● D值：即微生物的耐热参数，是指一定温度下，将试验微生物杀灭90%所需的灭菌时间或灭菌剂量。 ▲一般以时间（分）表示。D值越大，表明该微生物的耐热性越强。 ▲灭菌方法验证时，微生物的耐热参数一般使用D121℃。 ▲ D值需要特定的设备（抗力仪或油浴仪）方可测定。 

● 存活时间：将生物指示剂暴露于灭菌条件下一定时间（尽可能长时间）后，使所有生物指示剂培养结果均为阳性。 

● 杀灭时间：将所有生物指示剂暴露于灭菌条件下一定时间(尽可能短时间)后,使所有生物指示剂培养结果均为阴性。 F值又称杀菌值，由于微生物的种类和温度均为特指，通常F值要采用上下标标注，以便于区分。一般将标准杀菌条件下的F值记为在121℃热力致死温度下腐败菌的热力致死时间，用F0值表示。